细胞遗传学产前诊断技术与规范

　　产前诊断是在遗传咨询的基础上，应用现代医学、细胞遗传学、分子遗传学、医学影像学、免疫遗传学、生物化学等技术，对胚胎和胎儿的直接检测或通过对母体的检查，预测胎儿在子宫内生长发育状况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形，并提出医学建议，是预防出生缺陷患儿出生的有效手段。其中细胞遗传学是现在应用最为广泛的产前诊断手段，也是诊断染色体疾病的金标准。本文对细胞遗传学产前诊断的应用及技术规范做一介绍。

　　人类非显带染色体技术与各类显带技术的应用

　　1.1非显带染色体技术

　　非显带技术始于20世纪50年代末［1］，经非显带技术染色后的染色体呈均匀着色，其主要的特征为着丝粒的位置和染色体的相对长度。应用这一技术可以发现整倍体和部分非整倍体性核型，如21-三体综合征、Ph染色体等。但由于缺乏显带技术，无法精确辨认某一染色体的异常，只是在1960年Denver会议上依据染色体大小将其分为7组（A~G），并于1967年进一步修正，命名了染色体的臂、易位和其他异常。进入70年代，随着方法学上的进展，尤其是G、Q及R显带技术的应用［2］，许多染色体的数目及结构异常才得以精确地辨认。

　　1.2各类显带染色体技术

　　非显带的标本上虽然可以根据染色体的形态识别1、2、3、16、17和18号，有时还可以识别Y染色体，但不能鉴别其他大多数染色体。1970年Caspersson等首次报道用喹吖因对人染色体进行染色，可在各号染色体上显示出宽窄和位置不同带纹，在随后几年中，细胞遗传学工作者以不同的染色方法为基础，提出了各种显带方法和名称，如Q、G、R、C、T及N显带法等。

　　1.2.1G显带技术

　　G显带是最常用的，染色体经胰蛋白酶处理后，用一种能结合DNA的化学染料Giemsa染色，使染色体呈深浅不同的带型，人类的24种染色体可显示出各自特异的带纹。

　　1.2.2G-11显带技术

　　G-11显带是一种特异性显示9号染色体次缢痕的显带方法，一般用于9号染色体次缢痕多态性分析、家系调查、亲子鉴定等研究以及9号染色体倒位的细胞遗传学分析。

　　1.2.3R显带技术

　　R显带与G显带相反，染色体经热盐处理，使富含AT的DNA变性，用Giemsa染色，则可显示与G带正好相反的带纹，即G显带的深带变为浅带，浅带染成深带。当G显带显示的染色体两臂末端为浅带时，如果两臂末端发生缺失等异常，一般难以发现和识别，而R带正好能将此处显示出易于识别的深带。所以，R显带技术有利于检测染色体的末端缺失、重排等。

　　1.2.4C显带技术

　　C显带技术由Arrighi和Hsu于1971年发明，是显带技术中最简单的一种带型。其方法起源于原位杂交。Arrighi和Hsu发现用碱处理载玻片上的染色体使DNA变性后，再在SSC溶液中、65℃的条件下使其复性，在受控制的条件下经Giemsa染色可显示出在染色体的一定部位是深染的。20世纪70年代用原位杂交的方法证明深染的区域（C带区）是结构异染色质的区域，也就是一般而言的DNA高度重复序列的区域。然而，现在更为流行的看法认为氢氧化钡或其他碱性物质的处理是优先提取了非C带区的DNA，SSC的处理有助于带型的清晰。

　　1.2.5N显带技术

　　人类的近端着丝粒染色体（13、14、15、21和22号染色体）的次缢痕处与核仁的形成有关，故称为核仁形成区，它是中期染色体上的明显结构之一。应用DNA-RNA分子杂交技术，证明人类的18S和28S核糖体（rRNA编码结构）的基因（rDNA）位于核仁形成区。目前已有多种技术可以显示中期染色体上的核仁形成区。其中最简单而又准确的方法是银染法，即利用硝酸银将具有转录活性的核仁形成区（rRNA基因）特异性地染成黑色，人们将这种银染阳性的核仁形成区称为Ag-NOR，它们是具有转录活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。由于具有转录活性的rRNA基因（rDNA）往往伴有丰富的酸性蛋白质，该类蛋白质含有巯基（-SH)和二硫键（-S-S-），能使AgNO3中的Ag+还原成Ag颗粒。因此，有转录活性的核仁形成区常被镀上银颗粒而呈现黑色，没有转录活性的核仁形成区则不着色。故其着色程度与细胞中rRNA基因的转录活性相一致。在同一物种，Ag-NOR的数目以及它们在染色体上的位置是相对恒定的，如果发生了改变就意味着rRNA基因的活性发生了变化，故此项技术是目前探讨rRNA基因功能的方法之一。此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，这种联合可能是造成近端染色体不分离、断裂和易位的原因。利用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看到有银染物质相连。因此，银染近段着丝粒染色体联合可以作为准确地判断人体细胞是否存在近段着丝粒染色体随体联合的客观标准。

　　1.2.6T显带技术

　　端粒是维持染色体正常复制和上下代传递的3个基本功能单位之一。它的功能包括确保染色体末端的正常复制；防止断裂的DNA与染色体末端的重组。它们也是哺乳类动物生殖细胞减数第1次分裂时同源染色体配对的起始部位。每次细胞分裂，染色体丢失其末端的约100bp核苷酸，此变短的端粒可为细胞提供一有丝分裂的时钟。丢失的端粒序列可经端粒酶的作用逐个加回。T显带技术专门显示染色体端粒，可用于分析染色体端粒有无缺失、易位等畸变。T显带是R显带的亚类，因为特别地着色在端粒而称为T显带。T带是R带的最深染部分，必须用特殊的高热处理染色体，然后用Giemsa或荧光联合染色。

　　1.2.7各种带型的关系

　　经Q染色和G显带处理的染色体，在两臂上深带和浅带的分布基本一致，这种一致性提示了两臂上相应节段的一定结构和一定染色反应，R带型是Q带和G带型的反式，深带和浅带刚好颠倒，有助于探索Q带型和G带型浅染区的情况，特别是查明两臂末端的变化情况。T带也能反映染色体两端的畸变，C带型只限于着丝粒附近区段和几条染色体的次缢痕，N带仅在D、G组的特异区段显示。这是Q显带技术所不能显示的。所以上述各种带型联合起来，可以比较全面地反映染色体各个节段的结构和畸变，它们互相补充而不是互相矛盾。在实际工作中，如果有条件，最好联合采用几种显带技术，以便查明染色体变化的全貌。

　　1.2.8特殊显带技术

　　1.2.8.1姐妹染色单体互换技术

　　姐妹染色单体互换技术（sisterchromatidexchange，SCE）是指一条染色体的两条姐妹染色单体之间同源片段的交换［3］。这种交换是对等的、完全的，而且往往是对称性的。它实际上表示染色体复制过程中DNA双链的等位点交换。因此，它能敏感地显示出DNA的损伤。SCE虽然在真核生物细胞中以一定的频率发生，但在常规制备染色体标本中却不能观察到。1973年Latt等发现，在含5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸的培养基中生长的两个同期细胞，其染色体标本经某些荧光染料或Giemsa染色后，在姐妹染色单体之间显示出不同的着色强度，从而可用于检测SCE。

　　1.2.8.2X小体检测技术

　　用人体体细胞，如口腔上皮细胞或女性阴道上皮细胞，通过特异的处理和染色，在显微镜下可发现部分细胞核的内缘有一块染色较深、大小为1μm左右的呈半月形的小块，即X小体。有些细胞中，X小体的位置不在核膜的内缘，不容易与其他的染色质块区分，所以一般只用紧贴于核膜内缘的作为阳性。根据有关实验查明，一个分裂间期细胞核中仅有一条X染色体呈松散状态，参加细胞生理活动，另一条X染色体则仍保持异固缩的状态，所以染色较深而称为X小体。据此，正常男性个体不可能出现X小体；正常女性可能出现一个X小体。

　　1.2.8.3Y染色体检测技术

　　1970年Caspersson等发表了人类第1张中期染色体荧光带型照片，发现Y染色体长臂经荧光染料染色后具有特异的灰黄的荧光。随后，不同的研究者用同类的荧光染料对男性的各种间期细胞核，以及精子的头部进行染色，均可观察到一个类似于Y染色体长臂的直径约0.3μm的圆形或椭圆形的荧光灰黄的亮点。而在女性中则没有。从而确认Y小体是Y染色体长臂上的一部分。

　　1.2.9荧光原位杂交技术（FISH）

　　FISH的原理是将荧光素直接标记的核酸探针（或生物素、地高辛等标记的核酸探针）与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接或通过免疫荧光信号扩增在荧光显微镜下检测，从而对靶目标中的待测核酸进行定性、定位或定量的研究［4］。

　　细胞遗传学产前诊断的技术与规范

　　胎儿细胞可通过羊膜腔、脐血管和绒毛膜穿刺获取。获得的细胞经体外培养后收获、制片、显带，做染色体核型分析。

　　2.1基本要求

　　2.1.1机构设置

　　只有在经卫生行政部门许可的开展产前诊断技术的医疗保健机构才能实施。

　　2.1.2人员要求

　　从事胎儿染色体核型分析的人员必须符合《从事产前诊断卫生专业技术人员的基本条件》中有关要求。

　　2.1.3场所要求

　　场所应包含小手术室、接种培养室、标本制备室、实验室、暗室和洗涤室。各工作室应具备恒温设施，小手术室和接种培养室应具备空气消毒设施。

　　2.1.4设备要求

　　需要配置超声室，其中包括超声仪附穿刺引导装置，超声工作站(图文管理系统)各一；细胞遗传室，需配置普通双目显微镜，三筒研究显微镜附显微照像设备，超净工作台，二氧化碳培养箱，普通低速离心机，恒温干燥箱，自动纯水蒸馏器，恒温水浴箱，电冰箱，倒置显微镜附显微照相设备，荧光显微镜，分析天平，恒温培养箱，普通天平。

　　2.2管理

　　2.2.1建立规章制度

　　包括各级工作人员分工和职责，各项技术操作常规，消毒隔离制度，设备仪器和材料管理制度，资料信息档案和管理制度。

　　2.2.2知情同意

　　所有的操作必须在孕妇及其家属了解该技术的目的、局限性和风险，并签订了知情同意书后方可进行。

　　2.2.3所有操作必须按常规进行

　　手术操作后应做好手术记录。

　　2.2.4染色体核型分析报告

　　应由2名经认证审批的专业技术人员签发，审核人必须具有副高以上专业技术职称。

　　2.3产前诊断适应证、适宜检查时间及手术禁忌证

　　2.3.1产前诊断适应证

　　包括35岁以上的高龄孕妇，产前筛查后的高危人群，曾生育过染色体病患儿的孕妇，产前检查怀疑胎儿患染色体病的孕妇，夫妇一方为染色体异常携带者，孕妇可能为某种X连锁遗传病基因携带者，其他，如曾有不良孕产史者或特殊致畸因子接触史者。

　　2.3.2产前诊断时间

　　早孕绒毛采样检查宜在孕8～11周进行，羊水穿刺检查宜在孕16～21周进行，脐血管穿刺检查宜在孕18～24周进行。

　　2.3.3穿刺禁忌证

　　包括术前感染未治愈或手术当天感染及可疑感染者，中央性前置胎盘或前置、低置胎盘有出血现象，先兆流产未治愈者。

　　2.4技术质量标准

　　2.4.1技术程序

　　包括正确选择产前诊断适应证、时间和相关技术；在超声监护下做各种穿刺，2次穿刺未获标本者，2周后再进行穿刺。

　　2.4.2质量标准

　　包括各种穿刺成功率不得低于90%；羊水细胞培养成功率不得低于90%；脐血细胞培养成功率不得低于95%；在符合标准的标本、培养、制片、显带情况下，核型分析的准确率不得低于98%；绒毛染色体核型分析异常，必要时做羊水或脐血复核。

　　细胞遗传学产前诊断技术的局限性

　　细胞遗传学技术作为产前诊断的主要技术方法也有其局限性，例如只有6Mbp以上的结构异常才会被检测出，即使高分辨技术也只能检测到3Mbp以上的结构异常。胎儿细胞的获得需经羊膜腔、脐血管和绒毛膜穿刺，这种有创的产前诊断技术存在一定的风险，也给孕妇造成一定的心理压力。染色体分析技术对操作人员要求相对较高，也限制了细胞遗传学产前诊断技术的发展。随着产前诊断技术的发展，尤其是新一代测序技术的普及，相信会有越来越多的既安全又准确的技术来促进母婴保健及优生工作的发展。