无创性产前基因检测的临床应用

　　近年来，通过高通量测序技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA（cfDNA）筛查胎儿染色体多倍体异常的无创性产前检测（noninvasiveprenataltesting，NIPT）技术正越来越多地用于临床，其具有安全性、高效性及准确率高的特点，正在给产前诊断技术带来革命性的变化。NIPT技术可以3种途径介入产前检查：替代血清学筛查；替代有创产前产前诊断；作为血清学筛查与有创诊断的中间步骤。临床期待NIPT技术能够替代现行的孕妇血清学筛查与羊水胎儿脱落细胞染色体分析等有创产前诊断技术，国内外学者对此均陆续开展了相关的研究。本文将对NIPT技术及其相关的临床应用作一讲座。

　　一、NIPT技术　　NIPT技术相对于羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血穿刺而言，不需要经“有创穿刺”即可获得胎儿遗传物质进行相关的检测分析。虽然，Lo等[1-2]早在1997年已经证实孕妇外周血中存在cfDNA，且其含量与代谢半衰期等特点均适合用于产前检查，但直到高通量测序技术的出现才使得基于cfDNA的NIPT技术的临床应用成为可能[3]。孕妇血浆样品中可检测到母源性和胎源性的DNA分子，如果母体健康正常，基因组是整倍体，孕妇血浆DNA分子拷贝数的非整倍体偏差，一定是由胎儿染色体异常所致。采用高通量测序技术通过对孕妇外周血中各条染色体对应cfDNA拷贝数的检测，计算来源于21号、18号、13号等染色体的cfDNA是否增加，以筛查胎儿是否为唐氏综合征等。　　NIPT技术包括以下3种：　　1.鸟枪法大规模平行测序(s-MPS)技术：测序与计数孕妇血浆中点单基因位点DNA片段，根据对应某条染色体的单基因位点DNA片段相对过量（三体）或不足（单体）进行诊断。胎儿染色体非整倍体时相应的单基因位点DNA片段会有显著的增量或减少，但由于孕妇血中cfDNA组分有限，整倍体与非整倍体之间的差异很小，尤其当cfDNA组分较低时，需要计数大量的DNA片段。理论上讲，该技术可用于所有非整倍体的检测，对于非嵌合的21三体、18三体、13三体的检测有效性已经经过了临床验证[4]。　　2.靶向的大规模平行测序(t-MPS)技术：对目标染色体（如21号、18号以及13号染色体）进行选择性扩增，然后计算目标染色体是否相对过量。t-MPS不必对所有区域进行测序，检测成本相对低廉。从原理上看，该技术用于检测其他的染色体异常也是可行的[5]。　　3.基于单核苷酸多态性的NIPT技术：采用多重PCR技术扩增血浆中的DNA，1个PCR反应产生约20000个单核苷酸多态性（SNP），通过测序分析扩增产物，根据SNP在染色体的位置以及存在重组的可能性，计算出胎儿是正常倍体、非整倍体或三倍体（21三体、18三体、13三体以及性染色体异常）的最大似然比。该技术可以验证胎儿染色体同源的区域，因此，可以检出同源或者单亲二倍体。取父亲的血液或者唾液进行SNP分析可以提升检测性能。通过对目标区域的足量的SNP进行验证，该技术可以拓展到对其他染色体不平衡的检测，包括微缺失和微重复[6]。　　二、关于NIPT技术替代血清学筛查的临床应用研究　　NIPT技术问世以前，已经有多种血清学筛查方案用于临床，累积了庞大的筛查与诊断数据库。　　许多研究以现存的人群筛查数据，预测用NIPT技术替代现行的血清学筛查方案后对染色体异常检出率的影响。Susman等[7]对143051例孕妇采用NIPT技术替代传统的血清学筛查，结果发现，对染色体异常的检出率产生了重大影响，如果NIPT技术替代现行的21三体血清学筛查，则21三体的检出率会提高7%，检出的21三体从330例增加到355例，而对全部染色体异常检出率则降低28%，从740例降低到534例；若采用NIPT技术筛查扩大到21三体、18三体以及13三体，则漏筛的其他染色体异常则由231例降低到155例，对全部染色体异常的漏筛率则降为17%，诊断出的异常例数由740例降为610例（包括额外检出的25例21三体）；但NIPT技术的临床应用使有创产前诊断例数由8186例减少到1290例。Norton等[8]对美国加利福尼亚州130万余例孕妇的血清学筛查结果进行了分析，其中68990例(5.2%)为21三体及18三体筛查阳性，阳性孕妇中26059例(37.8%)接受了介入性产前诊断，结果2993例(11.5%)核型分析结果异常，其中的2488例（83.1%）能被NIPT技术检出，而506例（16.9%）则漏检。提示，用NIPT技术替代现行传统的血清学筛查，80%以上的染色体异常可被NIPT检出，约17%则会被漏筛，漏筛的非整倍体胎儿会发生中度或严重残疾。丹麦学者对193638例孕妇进行血清学筛查，其中10205例(5.3%)接受细胞遗传学或者分子遗传学检测，依据是否能被NIPT技术检测出、是否会影响其表型作为核型分析结果的分类，结果显示，1122例(11.0%)核型分析结果异常中有262例(23.4%)被NIPT技术漏检（非NIPT技术所能检测的核型异常），且这些异常通常是有重要临床意义的[9]。Syngelaki等[10]的研究结果显示，cfDNA检测代替现有的血清学联合筛查会影响对其他染色体异常的检出，对风险值≥1/100的1831例染色体异常中，21三体和（或）18三体和（或）13三体、性染色体非整倍体、三倍体以及其他不良结局高风险的染色体异常分别占82.9%、8.2%、3.9%和5.0%。以上这些研究表明，传统的血清学筛查发现的高风险人群中，除了21三体、18三体、13三体以外，还存在其他一系列的染色体异常，早孕期筛查发现的染色体异常中约30%是除了常见三体以外的其他染色体异常。NIPT技术如果替代目前的血清学筛查方案将对染色体异常的产前诊断结果产生较大影响，较大比例的核型异常会被NIPT技术漏筛，而且从成本效益分析看，NIPT技术替代目前的血清学筛查方案也不是最好的选择[11]。　　三、NIPT技术在高风险孕妇产前筛查中应用的研究　　对血清学筛查高风险孕妇行羊水穿刺获取胎儿细胞进行核型分析是确诊胎儿染色体是否异常的金标准。高通量测序的NIPT技术可检出21三体、18三体、13三体以及性染色体非整倍体疾病，并且有很好的特异性。NIPT技术是否可替代染色体核型分析用于血清学筛查高风险的孕妇？　　Syngelaki等[10]基于已有的有创产前诊断核型分析数据，对14684例在妊娠期间进行过绒毛活检染色体核型分析的单胎妊娠孕妇进行了追踪随访，结果显示，染色体核型[10]异常2030例（13.8%）。其中79.2%为21三体、18三体或13三体，8.4%为性染色体异常，3.9%为三倍体，8.5%为其他的染色体异常。为评估NIPT技术在不同产前诊断指征下的胎儿染色体异常检出率及漏诊率，南京大学医学院附属鼓楼医院对介入性产前诊断检出的156例染色体异常胎儿进行研究，有64例孕妇以血清学筛查高风险为产前诊断指征，其中50例被NIPT技术检出，14例漏诊，漏诊率为21.9%[12]。　　Norton等[13]进行的前瞻性队列研究结果显示，3228例血清学筛查高风险的孕妇在进行绒毛或羊水穿刺行染色体核型分析的同时采用NIPT技术检测，介入性产前诊断确诊的207例染色体异常胎儿中，21三体81例，NIPT检出率100%，假阳性率0.03%，18三体38例，NIPT检出率97.4%，假阳性率0.07%，结果表明，NIPT技术在21三体及18三体的诊断价值与介入性产前诊断价值相当。45岁及以上的高龄孕妇、胎儿颈部透明层厚度（NT）≥3.5mm或血清学筛查指标异常孕妇的胎儿发生“非典型”染色体核型异常的风险较高，NIPT技术会漏检“非典型”的核型异常[14]。　　有研究发现，NIPT筛查对35岁孕妇孕10周时的21三体、18三体、13三体的阳性预测值分别为99.4%、59.5%、44.4%，也就是说NIPT筛查对高风险孕妇18三体及13三体的阳性预测值低于60%[15]，NIPT检测与核型分析结果不一致，对此，应关注阳性预测值的价值。未来，NIPT技术或许可替代产前诊断中的传统核型分析，NIPT技术替代介入性产前诊断是所有孕妇与医疗者的期待，但要获得预期的临床效果尤其是在高风险孕妇群体中，还需进一步的研究。　　四、NIPT技术在孕早期联合筛查中度风险孕妇中应用的研究　　血清学筛查是目前应用最广泛的早孕期联合筛查方法。许多国家都将孕早期联合筛查方案（即血清学三联筛查方法）作为21三体筛查的标准方案，该方案的检出率约90%，假阳性率为3%~5%，而采用NIPT筛查则被认为有更高的检出率（99%）和更低的假阳性率（0.1%）[16-17]。Kagan等[18]对5种不同的筛查方案的筛查性能与成本进行了比较，结果显示，对血清学三联方法筛查出的中度风险孕妇再进行NIPT筛查，其检出率高达93%~94%，但其成本略高于血清学三联方法筛查方案，孕妇进行NIPT筛查的成本高，且会漏掉“非典型”的染色体异常（约占10%），而这些“非典型”染色体异常病例中的绝大多数都有NT结果异常或者血清学指标异常，因此认为，血清学三联方法筛查高风险孕妇可直接进行产前诊断，血清学三联方法筛查中度风险孕妇可以考虑选择进行NIPT筛查，中度风险孕妇进行NIPT筛查可帮助判断是否需要进行侵入性产前诊断，这一筛查策略保留了孕妇进行孕早期联合筛查的高筛查率，但学者们对高风险的切割值的划分从1/50到1/10不等。风险值特别高（>1/10）的孕妇或者超声检查发现胎儿结构异常的孕妇应直接进行产前诊断（核型分析+微阵列芯片分析），通常能够筛查出全部21三体中的70%，这部分孕妇妊娠“非典型”染色体异常胎儿的概率较大；85%的孕妇风险值<1/1000，这部分孕妇妊娠21三体胎儿的概率较小（占全部21三体的1%~2%）；风险值在1/1000~1/10之间的孕妇，可以进行NIPT筛查，好处在于4.5%的风险在1/300~1/10之间的孕妇可避免有创检查，但可能有少量的“非典型”染色体异常会漏检；风险值在1/1000~1/300之间的孕妇通常被告知属于低风险，应当让孕妇自主选择是否进一步行NIPT技术筛查；4.6%的孕妇风险值<1/300，这部分孕妇会选择侵入性产前诊断，在酌情自主选择筛查方法的模式下，选择进行NIPT筛查的孕妇占15%左右，采用这种筛查策略对21三体的检出率可提高8%。Syngelaki等[19]对1999—2013年期间在英国国王大学医院进行孕早期联合筛查与核型分析的孕妇筛查结果进行了回顾性分析，血清学联合筛查风险值≥1/10的孕妇进行绒毛取样术，风险值在1/2500~1/11之间的孕妇进行cfDNA检测，结果显示，采用这种筛查策略可以检出97%的21三体、98%的18三体与13三体、86%的X染色体单体、50%的47，XXY、47，XYY或47，XXX，以及50%的联合筛查可发现的其他染色体异常和1/3的三倍体。对NIPT筛查效率的研究统计结果显示，21三体检测灵敏度为99.5%，特异度为99.8%；18三体的检出率为99%，但对13三体的检出率相对较低，为79%~92%[20]，因此，NIPT技术与当前普遍应用的血清学筛查方案相结合应用更有价值。对早孕期联合筛查中度风险的孕妇酌情选择NIPT筛查的模式，保留了对全部孕妇进行孕早期联合筛查的高筛查效率。　　综上所述，NIPT技术可检出21三体、18三体、13三体以及性染色体非整倍体疾病，NIPT技术筛查阳性有很高的准确率，一定情况下可以作为传统血清学筛查的替代方案，同时也能够减少胎儿细胞遗传学检测等有创产前诊断。　　但是从目前的研究结果看，虽然NIPT技术有其独特的优势，NIPT尚不能完全替代传统的血清学筛查及有创检查，不论用于高龄孕妇一线筛查，还是部分替代胎儿染色体核型分析，均存在染色体异常漏检的风险。虽然在血清学联合筛查的基础上，对中度风险孕妇酌情进行NIPT技术筛查，可提高三体征的检出率，仍不能避免漏诊其他的非目标染色体异常。　　在实际临床诊疗工作中，需要对孕妇解释说明的是：NIPT技术与当前其他筛查方案一样，都不能百分之百检出所有的染色体异常，必要时还需要配合核型分析与染色体微阵列技术；而对于有羊水穿刺指征，而自愿选择NIPT筛查的孕妇，临床医师应充分告知其有漏检的可能性。医师、孕妇、医疗机构在评估使用传统筛查方法、侵入性产前诊断与NIPT技术的临床价值时应充分考虑到这些信息。